青鸟核酸

saRNA体外合成：

目前针对常规mRNA（1,000~5,000 nt）已有较为通用的体外转录（IVT）反应体系。但值得注意的是，现有体系并非适用于任意长度的mRNA。随着mRNA序列的延长，转录难度也会提高，并且更容易发生降解。

自复制mRNA（saRNA）包含目标蛋白编码序列、以及长度约7,000 nt的复制子骨架序列，整体长度在10,000 nt左右，其合成体系需进行定制化开发和优化。青鸟核酸RNASci研发团队针对saRNA优化了IVT反应体系，实现了较高的转录比和RNA完整性。

IVT反应体系（saRNA）：

反应体系	推荐浓度^a	推荐浓度^b	推荐浓度^c	推荐浓度^d	推荐浓度^e
DNA模板	1 μg	1 μg	1 μg	1 μg	1 μg
HEPES	40 mM	-	-	-	-
TRIS-HCl	-	40 mM pH 7.0	40 mM pH 7.0	40 mM pH 7.41	40 mM pH 7.0
二硫苏糖醇（DTT）	40 mM	10 mM	40 mM	40 mM	10 mM
RNase抑制剂	4 U	1 U/μL	1 U/μL	1 U/μL	1 U/μL
无机焦磷酸酶（PPase）	-	0.002 U/µL	0.002 U/µL	0.002 U/µL	0.002 U/µL
T7 RNA聚合酶	100 U	4 U/µL	4 U/µL	4 U/µL	4 U/µL
醋酸钠（NaOAc）	10 mM	-	-	-	-
Mg²⁺	75 mM	46.8 mM	10 mM	10 mM	50.97 mM
NTP	10 mM	7.78 mM	7.78 mM	7.78 mM	7.78 mM
DMSO	-	10%	0	10%	10%
亚精胺	0.2 mM	2 mM	4 mM	2.27 mM	2 mM

a: Robin J Shattock等优化了IVT体系，适用于高产量和高质量saRNA的合成;
b-e: A.K. Blakney等开发的IVT体系，适用于高产量(b), 高质量(c), 低dsRNA(d), 兼具产量和质量(e)的saRNA合成。

核苷酸修饰：

在mRNA疫苗中掺入修饰核苷酸（1mΨ）能够减少先天免疫反应，提升RNA稳定性，同时增强翻译效率，以上发现是mRNA疫苗开发中的重大突破。然而，对于saRNA疫苗来说，掺入1mΨ 对蛋白表达的影响是负面的。也有研究显示，胞嘧啶修饰核苷（如5mC）可抑制saRNA的天然免疫反应，打破了saRNA疫苗无法使用修饰核苷的固有认知。
目前，saRNA倾向于使用非修饰核苷，或者使用几种推荐的修饰核苷，例如5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲氧基胞嘧啶(5moC)和5-甲基尿嘧啶(m5U)。

天然核苷	修饰核苷
CTP	5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲氧基胞嘧啶(5moC)
UTP	5-甲基尿嘧啶(m5U)

saRNA的基础纯化：

与mRNA类似，实验室规模的saRNA纯化策略包括氯化锂沉淀和磁珠纯化，该方法制备纯化得到的saRNA完整性较低，常用于基础的细胞转染实验、酶法加帽反应等。
用于动物试验的saRNA通常需更高的纯度、以及更严格的dsRNA控制标准，因此更偏向于使用层析纯化方案。