青鸟核酸

体外转录（IVT，In Vitro Transcription）是批量制备mRNA的高效方法。IVT反应以含T7启动子的线性化DNA为模板，在RNA聚合酶作用下，以三磷酸核苷(NTPs)为底物合成mRNA。

核苷酸修饰是mRNA成药探索中的重大突破，可避免外源mRNA分子被细胞内的RNA传感器识别而激活先天免疫。因此，IVT过程常使用某种修饰核苷。

目前针对常规mRNA（1,000~5,000 nt）已有较为通用的IVT反应体系。但值得注意的是，现有体系并非适用于任意长度的mRNA。mRNA序列越长，转录难度越高，并且更容易发生降解，较长mRNA的合成体系需进行定制化开发和优化。

反应体系	各组分介绍
DNA模板	通常为带有相应启动子序列的线性化质粒或PCR产物，溶解在RNase-free H2O中。
二硫苏糖醇（DTT）	DTT是一种还原剂，在转录过程中维持酶的活性。
RNase抑制剂	抑制RNase的活性，维持mRNA的稳定性。
T7 RNA聚合酶	与启动子序列对应的RNA聚合酶（T7, SP6等），催化DNA转录形成RNA。
醋酸钠（NaOAc）	Mg²⁺是RNA聚合酶的辅因子，浓度过低会降低转录效率，浓度过高导致RNA降解。
NTP	NTP作为底物，是组成RNA的基本单元。
亚精胺	亚精胺能够稳定DNA-酶复合物，刺激转录反应；但过高浓度时存在抑制作用。
无机焦磷酸酶（PPase）	IVT反应中加入PPase能够避免无机焦磷酸离子（PPi）的累积，避免其与Mg²⁺螯合形成沉淀，从而保证一定的游离Mg²⁺。

2005年，Karikó和Weissman发表了突破性成果，将假尿苷添加到mRNA中有助于mRNA逃逸免疫系统攻击、显著提高蛋白的水平。Moderna、BioNTech开发的mRNA新冠疫苗均使用了核苷酸修饰mRNA。

目前用于mRNA的修饰核苷包括假尿嘧啶(Ψ)、N1-甲基-假尿嘧啶(N1Ψ)、5-甲基胞嘧啶(5mC)等。

天然核苷	修饰核苷
UTP	假尿嘧啶(Ψ), N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ), 2-氧甲基化假尿嘧啶, 5-甲基尿嘧啶(m5U), 5-甲氧基尿嘧啶(5moU), 2-硫尿嘧啶(s2U), 5-羟基尿嘧啶(5-hoUTP), 5-羟甲基尿嘧啶(5-hmUTP),5-羧基尿嘧啶(5-caUTP), 5-甲酰基尿嘧啶(5-FoUTP)
CTP	5-甲基胞嘧啶(m5C), 5-甲氧基胞嘧啶(5moC), 5-羟基胞嘧啶(5-hoCTP), 5-羟甲基胞嘧啶(5-hmCTP), 5-甲酰基胞嘧啶(5-FoCTP), 5-羧基胞嘧啶(5-caCTP)
ATP	6-甲基腺嘌呤(m6A), 1-甲基腺嘌呤(m1A)
GTP	1-甲基鸟嘌呤(m1G), 7-甲基鸟嘌呤(m7G), 噻吩鸟嘌呤(Thieno-GTP)

除目标mRNA外，IVT反应混合物中还包括未消耗底物和反应副产物，例如双链RNA（dsRNA），因此需进行产物的纯化。

实验室常用的mRNA纯化方法包括氯化锂沉淀、磁珠纯化，能够去除RNA外的杂质。该方法是较小规格mRNA的简易制备，样品常用于细胞转染实验、或进一步的加帽/加尾反应等。

用于动物试验的mRNA通常需更高的纯度，更严格的dsRNA控制标准，更偏向于使用层析纯化方案。

核苷酸修饰影响mRNA体外翻译效率

青鸟核酸测试了不同类型的修饰核苷对mRNA体外表达的影响。我们在IVT反应中掺入不同的修饰碱基，然而通过293T细胞试验评估增强绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA的表达水平。结果显示，核苷酸修饰对eGFP mRNA的荧光强度具有明显影响。